名称：基于GLCCI1基因rs37972位点用于儿童哮喘病检测的试剂、试剂盒及应用

专利人： 郑湘榕

专利号：201910567626.3

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基于GLCCI1基因rs37972位点用于儿童哮喘病检测的试剂、试剂盒及应用。

背景技术

支气管哮喘(bronchial asthma，简称哮喘)是一种以慢性气道炎症为特征的异质性疾病，主要临床表现为随时间不断变化和加剧的喘息、气短、胸闷、咳嗽等呼吸道症状，同时伴有可逆性呼气气流受限。全球哮喘患病人数约3.58亿，其中中国哮喘患者达三千万。调研数据显示，全球成人哮喘的平均发病率为4.3％；而儿童哮喘发病率在6～7岁儿童中为11.6％，13～14岁儿童中为13.7％，且各国之间差异较大，6～7岁儿童哮喘发病率最高达37.6％(哥斯达黎加)，13～14岁儿童中最高达31.2％(马恩岛)。在我国，2010年调查数据显示城区0～14岁儿童哮喘总患病率为3.02％，较2000年增长了52.8％，其中大城市增长更为显著。与此同时，哮喘的临床控制情况并不理想，数据表明，欧洲成人哮喘中未控制率达45％；而亚洲儿童哮喘未控制率更高，达53.4％。在我国，大于14岁哮喘患者中的控制率仅28.5％，儿童哮喘控制率不达10％。此外，尽管经过规范诊治，仍有3～4％的儿童期哮喘可持续至成人，30～50％的儿童哮喘在成人期复发。伤残调整生命年是指根据失去的健康年数，评估由于发病率和死亡率的疾病相关信息而丧失的健康寿命年数；而全球哮喘约占所有疾病伤残调整生命年的1.1％，达2600万人次/年。哮喘的高发病率及低控制率，不仅影响儿童期的成长发育及学习生活，还与成人期的工作劳动能力下降密切相关，给家庭、卫生系统和整个社会造成了沉重的负担。因此，探讨导致哮喘发生及治疗反应欠佳的因素，在儿童时期积极采取相关措施控制哮喘发病率、提高哮喘控制率，将对减轻我国公共卫生事业负担有极大帮助。

哮喘是由多种因素综合作用的结果，包括遗传、环境、感染等，遗传因素在其中占重要地位。哮喘的发生及对药物治疗的反应与基因变异密切相关，具有种族、性别、环境等差异。通过全基因组关联研究(Genome-wide association study，GWAS)已发现哮喘相关候选基因超过1000个，目前在人群中得到验证的基因约50余个。这些基因的变异可影响哮喘的发生、严重程度及对各种治疗药物的反应。

目前临床上用于治疗哮喘的药物主要为吸入糖皮质激(inhaled corticosteroids，ICS)、β2受体激动剂、白三烯调节剂和抗胆碱能药物。近年来，随着哮喘分子机制研究的逐渐深入，直接针对炎症介质的抗体相继出现。2018年GINA指南已将抗IgE抗体(omalizumab)、抗IL-5抗体(mepolizumab)及抗IL-5受体抗体(benralizumab)推荐应用于临床治疗成人难治性哮喘，另有针对IL-4、IL-13、IL-17、TNFα等多种炎症因子的抗体已进入临床实验阶段。但不同个体对药物的反应具有较大差异，高达40％的哮喘患者对药物治疗无反应，另有部分患者使用药物后药物毒副作用明显，死亡风险增加。广泛存在的个体差异支持哮喘患者对治疗药物的反应与基因变异密切相关。

ICS是GINA哮喘指南推荐用于控制哮喘发作的首选用药。促肾上腺皮质激素释放激素与促肾上腺皮质激素释放激素受体1(corticotropin-releasing hormone receptor 2，CRHR1)结合，促进下游促肾上腺皮质激素的分泌，作用于肾上腺皮质进而促进糖皮质激素的分泌。糖皮质激素(Glucocorticoids，GCs)与细胞膜上糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)结合，抑制炎症基因的激活，增强抗炎基因的转录，缓解炎症反应；还可抑制细胞介导的免疫反应，产生免疫抑制作用。大部分患者经药物治疗后，哮喘症状可以得到控制，但小部分患者治疗效果欠佳，甚至哮喘症状加深。其原因在于，人体中某些基因与GCs作用通路与哮喘的发生及ICS疗效相关。针对不同的人群，通过检测生物标志物来为个体制定特定的医疗方案成为治疗的趋势，寻找影响汉族儿童哮喘发病及ICS疗效的遗传学因素是目前急需要解决的问题。2015年在美国启动的精确医疗倡议利用大型数据库、研究(包括蛋白质组学、代谢组学和基因组学)及算法寻找可用于临床的生物标志物。基于遗传学因素与哮喘的显著相关性，寻找与哮喘发生及药物效应相关的遗传标记将有助于推动哮喘的个体化治疗。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种基于GLCCI1基因rs37972位点用于儿童哮喘病检测的试剂、试剂盒及应用。试剂是用于测定GLCCI1基因rs37972位点的基因型，根据其基因型将儿童哮喘病人进行分类，对哮喘的发生进行早期遗传学预测，从而进行针对性治疗。其应用方法简便、快速。

本发明提供了一种基于GLCCI1基因rs37972位点用于儿童哮喘病检测的试剂，包括PCR反应体系、SAP反应体系和iPLEX延伸体系，

所述PCR反应体系包括：根据GLCCI1基因rs37972位点设计的引物对、PCR Buffer、MgCl2、Taq酶、dNTP；

所述SAP反应体系包括虾碱性磷酸酶、SAP Buffer和去离子水；

所述iPLEX延伸体系包括iPLEX Buffer、iPLEX Enzyme、iPLEX Termination mix、Primer Mix和去离子水。

上述基于GLCCI1基因rs37972位点用于儿童哮喘病检测的试剂，进一步的，所述PCR反应体系中所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

上述基于GLCCI1基因rs37972位点用于儿童哮喘病检测的试剂，进一步的，所述PCR反应体系包括1.625mM的MgCl2、500μM的dNTP、100μM的引物对、0.5U/rxn的Taq酶、1.25x PCR Buffer和去离子水。

上述基于GLCCI1基因rs37972位点用于儿童哮喘病检测的试剂，进一步的，所述SAP反应体系包括1U/μl的虾碱性磷酸酶、10x SAP Buffer和去离子水。

上述基于GLCCI1基因rs37972位点用于儿童哮喘病检测的试剂，进一步的，所述iPLEX延伸体系包括0.222x iPLEX Buffer、1x iPLEX Termination mix、1x iPLEX Enzyme、Primer Mix。

基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种用于儿童哮喘病检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述的基于GLCCI1基因rs37972位点用于儿童哮喘病检测的试剂。

基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种基于GLCCI1基因rs37972位点用于儿童哮喘病检测的试剂在制备用于预测儿童患哮喘病风险的试剂盒中的应用，包括以下步骤：

S1、将待测物DNA，通过所述PCR反应体系进行PCR扩增得到PCR产物；

S2、将所述PCR产物置于所述SAP反应体系中进行SAP反应得到SAP处理液；

S3、将所述SAP处理液加入所述iPLEX延伸体系中进行延伸反应得到iPLEX处理液；

S4、将所述iPLEX处理液纯化后进行基因测序，若GLCCI1基因rs37972位点基因型为TT或CT，采用ICS治疗后，MMEF改善较小。

上述的应用，进一步的，所述S1中所述PCR扩增具体为：94℃预变性5min、94℃变性20sec、56℃退火30sec、72℃延伸1min；循环变性、退火、延伸步骤45次；在72℃最后延伸3min，4℃取出。

上述的应用，进一步的，所述S2中所述SAP反应具体为：37℃反应20min、85℃反应5min、4℃取出。

上述的应用，进一步的，所述PCR产物与所述SAP反应体系的体积比为5︰2。

上述的应用，进一步的，所述S3中所述延伸反应具体为：

S3-1、94℃预变性30sec；

S3-2、94℃变性5sec、52℃退火5sec、80℃延伸5sec、

S3-3、循环所述S3-2中退火和延伸5次；

S3-4、循环S3-2、S3-3步骤40次；

S3-5、在72℃下最后延伸3min，4℃取出。

上述的应用，进一步的，所述S3中，所述SAP处理液与所述iPLEX延伸体系的体积比为7︰2。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明提供了一种用于检测儿童哮喘的检测试剂盒，该检测试剂盒是基于GLCCI1基因设计的，通过考察GLCCI1基因rs37972位点的基因型，确定该儿童哮喘发病风险是否增加，以及使用ICS治疗的效果。本申请首次发现GLCCI1基因rs37972位点的基因型为TT及CT的哮喘病患儿，采用ICS治疗后，MMEF改善较小。因此，采用本申请的检测试剂盒，可以对哮喘的发生以及对使用ICS治疗的哮喘儿童进行早期遗传学预测，指导临床选药，选择合适的治疗方案，推进个体化治疗的实施。

(2)本发明提供了一种用于检测儿童哮喘的检测试剂盒，包括PCR反应体系、SAP反应体系和iPLEX延伸体系。PCR反应体系将GLCCI1基因扩增出来；SAP反应体系可以去除体系中游离的dNTPs。

(3)本发明提供了一种用于检测儿童哮喘的检测试剂盒的应用方法，可以基于GLCCI1基因rs37972位点上的基因型提前预估儿童患有哮喘病的风险及采用ICS治疗的效果，从而提早干预，具有简便、快速等优势。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为本发明实施例4中GLCCI1基因上rs37972SNP与儿童哮喘肺功能改善之间的关系图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例1：

一种用于检测儿童哮喘病的检测试剂，包括：PCR反应体系、SAP反应体系和iPLEX延伸体系。

PCR反应体系总体积为5μL，具体包括1.625mM MgCl2、500μM dNTP、50μM上游引物、50μM下游引物、0.5U/rxn Taq酶、1.25x PCR Buffer和去离子水。

其中上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

ACGTTGGATGCACGAGCAGACCAATTTGAC。

下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

ACGTTGGATGCGGGAGCAATTAATGTAAGG。

SAP反应体系总体积为7μl，其成分包括：1U/μl虾碱性磷酸酶、10x SAP Buffer和去离子水。

iPLEX延伸体系总体积为9μl，其成分包括：0.222x iPLEX Buffer、1x iPLEX Termination mix、1x iPLEX Enzyme、Primer Mix(7μM︰14μM)。

实施例2：

一种用于检测儿童哮喘病检测的试剂盒，包括实施例1的试剂。

实施例3：

一种实施例1的试剂在制备用于预测儿童患哮喘病风险的试剂盒中的应用，其应用方法包括以下步骤：

(1)考察对象的选择：

募集中南大学湘雅医院儿科门诊确诊的汉族哮喘儿童263例，平均年龄8.18(±2.73)岁。同时募集中南大学湘雅医院儿科就诊的健康对照儿童150例，平均年龄8.20(±2.28)岁。同时，将上述儿童按年龄大小分为大于及等于6岁组(A组)和小于6岁组(B组)。

哮喘组纳入标准：

1、符合2016年中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》中关于哮喘的诊断标准。

2、1月内无呼吸道感染及全身感染病史、急性哮喘发作住院病史，无规律使用ICS病史。

3、不存在以下疾病：①先天性气道、肺实质发育异常；②气道内阻塞或管外压迫；③先天性心脏病；④活动性肺结核；⑤支气管扩张；⑥吸入糖皮质激素、β2受体激动剂过敏；⑦严重的心、肝、肾及其他全身性疾病。

4、取得家长的知情同意并当面签署知情同意书。

对照组纳入标准：

1、无支气管哮喘、毛细支气管炎史，无湿疹、过敏性鼻炎、特应性皮炎等过敏性疾病史，且均无过敏性疾病家族史。

2、无心、肝、肾及其他全身性疾病。

(2)DNA的提取：

1、使用EDTA抗凝无菌真空采血管抽取哮喘组和对照组儿童外周静脉血2ml，采取后4小时内置于-80℃超低温冰箱冷冻保存。

2、采用全血DNA试剂盒(SQ Blood DNA KitⅡ，Omega，美国)，进行DNA提取。具体包括以下步骤：

2.1、取2ml解冻后的血细胞，加至15ml无核酸的离心管中，加入5ml Buffer NL上下颠倒5次混匀，常温下使用离心机2000g离心5分钟。

2.2、弃上清液，将离心管45°倾斜倒置在干净的纸巾上2分钟，使上清液去除完全。

2.3、加入1ml Buffer XL/蛋白酶OB混合液，涡旋混匀直至沉淀完全溶解。

2.4、将样品放置65℃水浴30分钟后，取出，加入1ml异丙醇，缓慢上下颠倒混匀30次。

2.5、常温下2000g离心5分钟，弃上清液，将离心管45°倾斜倒置在干净的纸巾上。

2.6、加入70wt％乙醇1ml，涡旋混匀10秒，常温下2000g离心3分钟。

2.7、弃上清液，将离心管45°倾斜倒置在干净的纸巾上，空气干燥15分钟。

2.8、加入500μl Buffer EB，涡旋混匀1分钟。

2.9、将样品放置65℃水浴10分钟。

2.10、将DNA放置4℃冰箱过夜，转移至96孔板，-20℃冰箱保存。

(3)PCR扩增：

3.1、取实施例2的检测试剂盒，对步骤2的DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系参见表1。

表1：PCR master mix反应相关试剂配制组分

成分 浓度 体积(1rxn) 去离子水 NA 1.850μl PCR Buffer(含有15mM MgCl2) 1.25x 0.625μl MgCl2 1.625mM 0.325μl dNTP Mix 500μM 0.100μl Primer Mix 100μM 1.000μl HotStar Taq 0.5U/rxn 0.100μl Total - 4.000μl

3.2、选用12道移液器，在384孔板的每个加样孔中加入4μl PCR反应体系，最后加入1μl步骤(2)提取的模板DNA(20ng/μl)混匀，小心盖上384孔封板膜并压紧每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。常温下1000g离心3分钟。

3.3、设置如下PCR扩增反应程序，将PCR反应板放置于PCR仪上，启动程序：94℃预变性5min、94℃变性20sec、56℃退火30sec、72℃延伸1min；循环变性、退火、延伸步骤45次；在72℃最后延伸3min，4℃取出得到PCR产物。

(4)虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)反应：将PCR产物用SAP处理，以去除体系中游离的dNTPs。具体步骤为：

4.1、在新1.5ml EP管中配制SAP反应体系，具体成分参见表2。

表2：SAP反应体系的成分表

成分 浓度 体积(1rxn) 去离子水 NA 1.53μl SAP Buffer 10x 0.17μl 虾碱性磷酸酶 1U/μl 0.30μl 总体积 - 2.00μl

4.2、将SAP反应体系加入384孔PCR反应板，对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应总体积为7μl，其中PCR产物5μl，SAP反应体系2μl。

4.2、小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序，并将384孔反应板放置于PCR仪上，启动程序。

设置SAP反应程序：37℃20min；85℃5min；4℃∞。得到SAP处理液。

(5)单碱基延伸(iPLEX)反应：在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应。

5.1、在新1.5ml EP管中配制单碱基延伸反应体系，反应体系总体积9μl。

其延伸反应体系成分参见表3。

表3：延伸反应组分

成分 浓度 体积 去离子水 NA 0.619μl iPLEX Buffer Plus 0.222x 0.200μl iPLEX Termination mix 1x 0.200μl Primer Mix 0.625μM:1.25μM 0.940μl iPLEX Enzyme 1x 0.041μl 总体积 - 2μl

5.2、将EXTEND Mix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，加入2μliPLEX反应体系、7μlSAP处理液。

5.3、移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压紧每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象，离心后进行表4的反应程序得到延伸产物。

表4：延伸反应程序



(6)树脂纯化

6.1、在上述得到的延伸产物384/6MG Dimple板均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干。

6.2、在384样本板的每个孔中加16μl水。

6.3、将384样本板轻轻翻转过来扣在Dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中。

6.4、将384样本板放置翻转离心机中室温旋转混匀30分钟。

(7)芯片点样

启动Mass ARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至SpectroCHIP芯片上。

(8)质谱检测及数据输出

将点样后的Spectro CHIP芯片使用MALDI-TOF质谱仪分析，检测结果使用TYPER4.0软件获取原始数据及基因分型图，检查数据文件的完整性和正确性，将结果存入相应存储媒介。

(9)检测结果

9.1、与儿童哮喘ICS治疗后的肺功能变化

考察GLCCI1基因rs37972位点不同基因型与儿童哮喘肺功能改善之间的关系，图1为GLCCI1基因rs37972位点不同基因型的肺功能变化情况。从图中可知：rs37972位点不同基因型与儿童哮喘肺功能改善有关，与野生基因纯合子CC患儿相比，表达变异基因型TT及CT的哮喘患儿MMEF改善较小(12.23±17.58％，21.08±21.03％，P<0.05)。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。