名称：一种培养脂肪间充质干细胞球状体的方法

专利号：202110708778.8

专利人：贺巾帼

技术领域

本发明涉及脂肪间充质干细胞培养领域，具体为一种培养脂肪间充质干细胞球状体的方法。

背景技术

干细胞有许多种类，包含胚胎，脐带，脂肪，诱导型多能干细胞，但是脂肪间充质干细胞3d培养的技术却极少。脂肪间充质干细胞最常被拿来做为修复组织的一种干细胞，依照组织来源，脂肪是最容易取得并且细胞生长型态也最相近于结缔组织的生长模式。干细胞培养技术以2D培养为目前最常使用的方法，细胞3D培养则是为了模拟体内细胞环境而产生出来的一种新兴方式，3D组织或是类组织培养目前是一种新的细胞治疗技术，但是培养成球状体是不容易的，以细胞特性来说，间充质干细胞是贴壁细胞，生长在平面的培养皿上，形成球状体需要一些技术介入，使细胞之间的连结改变为球状。

市场上有许多种类针对3D培养环境为基础的商业用商品，对于细胞的方面大部分的研究为肿瘤细胞以及胚胎干细胞，脂肪间充质干细胞的培养方法难以寻找。

因此上述反映的技术问题是本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种培养脂肪间充质干细胞球状体的方法，以3D培养环境来培养来放大干细胞球状体，利用此技术作为立体组织培养的基本条件，扩增细胞球体的直径大小，可解决困难培养成干细胞球状体的情况。

为实现上述目的，采用如下技术方案：一种培养脂肪间充质干细胞球状体的方法，包括如下步骤：

S1将细胞密度>80％的人脂肪间充质干细胞进行解离；

S2离心并确认细胞团块在15ml离心管底，然后加入6ml培养基均匀混合；

S3使用6公分培养皿，移液量调整为25-27uL，下盘加入PBS缓冲液7ml，确保细胞滋润度，上盘扑满细胞点，小心转过并覆盖到下盖上，放入培养箱3天；

S4三天后慢慢的冲洗下，此为干细胞球状细胞团块液，离心转速1500rpm5分钟；

S5将上清液弃掉，确认管底细胞团块，加入2ml培养液混合；

S6显微镜下确认团块，数细胞团块，确保细胞团块的数量在50颗以上；

S7使用96孔盘，每一个孔打入50uL；

S8球状细胞液打入Hystem水凝胶细胞培养支架，之后每2-3天换液一次，持续培养7-14天；

S9检测分析：(1)细胞染色；(2)分析细胞团块直径大小与数量；(3)共轭胶显微镜3D影像。

本发明与现有技术相比的优点在于：以此技术为培养干细胞球体的方法，作为扩增前的球状干细胞培养步骤，预计朝向应用在结缔组织型态的伤口或者皮肤修复，例如慢性伤口组织再生、困难伤口的修补，可减少医疗照护的瓶颈与医疗耗费的成本。